稀释法测定最小抑菌浓度（MIC）是一种评估抗菌剂抑制微生物生长能力的重要实验技术，主要包括微量稀释法和常量肉汤稀释法两种。微量稀释法因其操作简便、成本较低以及适合高通量筛选的特点，非常适合自动化操作和精确控制药物浓度。而常量肉汤稀释法则直观易行，适合实验室规模的测试，且可以根据实验要求灵活调整药物浓度和培养基体积。

琼脂稀释法

本实验采用琼脂稀释法，将不同浓度的抑菌剂混合并溶解于琼脂培养基中，然后点种细菌。通过观察细菌的生长与否，可以确定抗菌物质抑制受试菌生长的最低浓度，即最小抑菌浓度（Minimal Inhibitory Concentration，MIC）。该方法特别适用于不溶性抗菌产品。

操作步骤

1. 抗菌溶液的配制：在无菌条件下取5ml或5g样品（固体研磨后），加入45ml灭菌磷酸缓冲液中，充分震荡溶解，制成10%的均匀分散溶液或悬液。
2. 含抗菌剂培养基的制备：将10%的抗菌溶液用PBS进行系列稀释，得到不同浓度的受试液，置于45℃～50℃水浴保温。
3. 双倍浓度培养基的制备：称取76g MH琼脂培养基，溶解于1000ml水中，加热至沸腾并121℃高压蒸汽灭菌15min，存放在45℃～50℃水浴中备用。
4. 含抗菌液的培养基配制：将10ml系列稀释的抗菌液加入平皿中，迅速加入10ml的双倍MH琼脂培养基，边加边摇匀，待凝固后备用。
5. 接种操作：使用加样器取1μl～2μl的细菌悬液（约107 cfu/ml）点种于含抗菌液的平皿，接种后形成的菌液圈直径应为5mm～8mm（每个点菌量约为104 cfu）。
6. 阳性对照：采用同样方法接种不含抗菌成分的MH琼脂平板，作为阳性对照。
7. 培养观察：将接种后的平板在35℃培养箱中倒置培养18h～24h，观察结果。

评判标准

完全抑制菌落生长的最低抗菌液浓度即为该样品对受试菌的MIC，单一菌落生长可忽略不计。

肉汤稀释法

本实验将不同浓度的抑菌剂混合并溶解于营养肉汤培养基中，然后接种细菌，依据细菌的生长情况确定抗菌剂抑制受试菌生长的最低浓度，即最小抑菌浓度（MIC）。该方法适用于可溶性抑菌产品。

操作步骤

1. 按照规定方法制备金黄色葡萄球菌及大肠杆菌悬液。
2. 含抗菌剂培养基的制备：将抗菌溶液用蒸馏水进行系列稀释成不同浓度的受试液，每种稀释度取25ml加入含25ml双倍浓度营养肉汤的试管中。
3. 接种：取0.1ml（约108 cfu/ml）菌悬液接种于含抗菌剂的营养肉汤试管中，作为实验组。
4. 阳性对照：同样方法接种不含抗菌剂的营养肉汤试管中。
5. 阴性对照：取2支含营养肉汤的试管，作为阴性对照组样本。
6. 培养观察：将所有试管放入37℃培养箱中，培养48h，观察结果。
7. 计数：在试验中须对菌悬液进行活菌计数，合适的作用浓度需在5×10⁵ cfu/ml～5×10⁶ cfu/ml之间。

评判标准

当阳性对照管中观察到细菌生长（混浊），而阴性对照管中无菌生长（透明），若实验用菌悬液的作用浓度在5×10⁵ cfu/ml～5×10⁶ cfu/ml之间，则试验组无菌生长的最高稀释度所对应的抗菌剂浓度，即为该样品对受试菌的MIC。

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